KUL. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Dan l-aħħar intwera li l-fungus ascomycete Ilyonectria crassa huwa kapaċi jinfetta t-tuberi tal-patata. Dan ix-xogħol huwa l-ewwel wieħed li janalizza l-karatteristiċi bijoloġiċi u r-reżistenza għal xi fungiċidi tar-razza I. crassa iżolata mill-patata. Is-sekwenzi ta 'reġjuni speċifiċi għall-ispeċi tar-razza "patata" ħabtu ma' dawk miksuba qabel għal fungi iżolati mill-għeruq ta 'daffodil, ġinseng, aspen u fagu, basal tal-ġilju u weraq tat-tulipani. Apparentement, ħafna pjanti selvaġġi u tal-ġnien jistgħu jkunu riservi ta 'I. crassa. Ir-razza investigata infettat it-tadam u l-flieli tal-patata, iżda ma infettatx il-frott kollu tat-tadam u t-tuberu tal-patata intatt. Dan juri li I. crassa huwa parassita tal-ferita. Evalwazzjoni tar-reżistenza għal fludioxonil, difenoconazole u azoxystrobin fuq mezz ta 'nutrijent uriet effikaċja għolja ta' dawn il-mediċini.
L-indiċi EC50 (il-konċentrazzjoni tal-funġiċida, li tnaqqas il-veloċità b'2 darbiet ir-rata ta 'tkabbir radjali tal-kolonja relattiva għall-kontroll funġiċida) kienet ugwali għal 0.4; 7.4 u 4 mg / l, rispettivament. Il-possibbiltà tal-iżvilupp tal-marda kkawżata minn I. crassa għandha titqies meta ssir stima fitopatoloġika tat-tuberi tal-patata u l-iżvilupp ta 'miżuri għall-protezzjoni tal-pjanti.
L-iżvilupp ta 'mikroorganiżmi fitopatoġeniċi jwassal għal telf għoli fl-istadji kollha tat-tkabbir u l-ħażna tal-patata. Meta jkunu qed jiġu ppjanati miżuri protettivi, bħala regola, jittieħdu in konsiderazzjoni patoġeni magħrufa, bħal speċi tal-ġeneri Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, eċċ. Il-bijoloġija tagħhom hija studjata ħażin, l-effettività tal-funġiċidi użati fuq il-patata fir-rigward tagħhom mhix magħrufa, il-metodi dijanjostiċi ma ġewx żviluppati. Bl-iżvilupp tal-massa, huma kapaċi jikkawżaw ħsara sinifikanti lill-uċuħ tal-patata. Wieħed minn dawn il-mikro-organiżmi huwa l-fungus ascomycete Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, l-ewwel skopert mill-awturi fuq tuberi tal-patata (Chudinova et al., 2019).
Dan ix-xogħol jippreżenta r-riżultati tal-analiżi tar-razza I. crassa iżolata mit-tuberi tal-patata. Il-morfoloġija tal-kolonji u l-istrutturi miċeljali ta 'I. crassa, ġew studjati sekwenzi ta' nukleotidi ta 'reġjuni tad-DNA speċifiċi għall-ispeċi, il-virulenza għall-patata u t-tadam, u r-reżistenza għal xi fungiċidi popolari.
materjali u metodi
Aħna użajna r-razza I. crassa 18KSuPT2 iżolata fl-2018 mit-tuberu tal-patata infettat imkabbar fir-reġjun ta 'Kostroma. It-tuberu kien affettwat minn tip ta 'taħsir niexef b'kavità mgħottija bil-miċelju kannella ċar. Bl-użu ta 'labra sterili li tiddissettja, il-miċelju fungali ġie trasferit f'dixx Petri b'medju agar (birra 10%, agar 1.5%, peniċillina 1000 U / ml). Il-pjanċi ġew inkubati fid-dlam f'24 ° C.
Mikroskopju tad-dawl Leica DM2500 b’kamera diġitali ICC50 HD u mikroskopju binokulari Leica M80 b’kamera diġitali IC80HD (Leica Microsystems, il-Ġermanja) intużaw biex jimmarkaw, jevalwaw id-daqs u l-morfoloġija ta ’spori u organi ta’ spori.
Biex jiġi iżolat id-DNA, il-miċelju fungali tkabbar f'mezz tal-piżelli likwidu, imbagħad iffriżat f'nitroġenu likwidu, omoġenizzat, inkubat f'buffer CTAB, purifikat bil-kloroform, u maħsul darbtejn b'2% alkoħol.
Il-metodu ta 'estrazzjoni tad-DNA huwa deskritt fid-dettall fl-artiklu minn Kutuzova et al. (2017).
Biex tiddetermina l-ispeċi b'metodi molekulari u tqabbel ma 'razez oħra magħrufa ta' I. crassa, PCR twettqet b'primers li jippermettu amplifikazzjoni ta 'reġjuni tad-DNA speċifiċi għall-ispeċi: ITS1-5,8S-ITS2 (primers ITS5 / ITS4, White et al., 1990), reġjuni tal-ġene b -tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) u fattur ta 'titwil ta' traduzzjoni 1α (tef1α) (primers EF1-728F / EF1-986R, Carbone u Kohn, 1999). Amplicons tat-tul mixtieq ġew estratti mill-ġel bl-użu tal-kit Evrogen CleanUp. Ir-reġjuni amplifikati ġew sekwenzjati bl-użu tal-BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) fuq Applied Biosystems 3730 xl sequencer awtomatizzat (Applied Biosystems, CA, USA). Is-sekwenzi ta 'nukleotidi miksuba ntużaw biex tfittex taqbila fid-database GenBank taċ-Ċentru Nazzjonali ta' l-Istati Uniti għall-Informazzjoni dwar il-Bijoteknoloġija (NCBI). Analiżi filoġenetika twettqet bl-użu tal-programm MEGA 6 (Tamura et al., 2013).
Id-determinazzjoni tal-virulenza twettqet fuq frott aħdar sħiħ ta 'tadam ta' frott kbir (varjetà Dubrava) u tuberi tal-patata (varjetà Gala). Barra minn hekk, biex nissimulaw ħsara lil frott u tuberi bil-ħsara, użajna flieli tal-istess frott u tuberi. Flieli ta 'tuberi tqiegħdu fi kmamar umdi, li kienu platti Petri b'karta filtru mxarrba fil-qiegħ. Slitta tpoġġiet fuq il-karta, li fuqha, imbagħad, tqiegħdu flieli ta 'tuberi jew frott. Tuberi sħaħ u frott tqiegħdu wkoll f'kontenituri b'karta filtru mxarrba fil-qiegħ. Fiċ-ċentru tal-porzjon (jew fuq il-wiċċ intatt tat-tuberu jew tal-frott), biċċa agar (5 × 5 mm) b'ifa fungali tqiegħdet wara 5 ijiem ta 'tkabbir fuq wort agar.
Il-valutazzjoni tar-reżistenza ta 'razez fungali għal funġiċidi twettqet f'kundizzjonijiet tal-laboratorju fuq medju ta' nutrijent agar. Aħna studjajna s-suxxettibilità għal drogi funġiċidi Maxim, KS (ingredjent attiv fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenoconazole 250 g / l) (Katalgu tal-Istat ..., 2020). L-evalwazzjoni twettqet fil-platti Petri fuq medium wort-agar biż-żieda tad-drogi studjati f'konċentrazzjonijiet tas-sustanza attiva 0.1; waħda; 1 ppm (mg / L) (għal fludioxonil u difenoconazole), 10; għaxra; 1 ppm (għal azoxystrobin) u fil-midja mingħajr funġiċida (kontroll). Il-funġiċida ġie miżjud mal-mezz imdewweb u mkessaħ għal 10 ° C medium, wara li l-medium ġie mferra 'fil-platti Petri. Blokk agar bil-miċelju fungali tqiegħed fiċ-ċentru ta 'dixx Petri u kkultivat f'temperatura ta' 100 ° C fid-dlam. Wara 60 ijiem ta 'inkubazzjoni, id-dijametri tal-kolonji ġew imkejla f'żewġ direzzjonijiet reċiprokament perpendikulari; ir-riżultati tal-kejl għal kull kolonja ġew ikkalkulati bħala medja. L-esperimenti saru fi tliet kopji. Ibbażat fuq ir-riżultati tal-analiżi, l-EC24 ġie kkalkulat, ugwali għall-konċentrazzjoni tal-funġiċida, li tnaqqas bin-nofs ir-rata tat-tkabbir radjali tal-kolonja relattiva għall-kontroll funġiċida.
riżultati u diskussjoni
Fuq il-platti Petri bl-agar tal-wort, il-fungus ifforma kolonji b'miċelju flokulenti abjad. Il-medium taħt il-miċelju sar kannella fl-aħmar. Meta l-medium jinxef, il-fungus ifforma spori ta 'żewġ tipi fuq konidiofori singoli u aggregati fi sporodochia żgħira. Il-makrokonidji huma tawwalija, ċilindriċi, b'septa waħda sa tlieta, tul medju ta '27.2 µm b'firxa ta' valuri minn 23.2 sa 32.2 µm, wisa 'sa 4.9 µm (Fig. 1). It-tul medju tal-mikrokonidja huwa 14.3 µm b'firxa ta 'valuri minn 10.3 sa 18.1 µm, il-wisa' hija sa 4.0 µm. Il-karattri makro- u mikromorfoloġiċi kollha jidħlu fil-firxa tal-varjazzjoni tal-ispeċi Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Is-sekwenzi ta ’reġjuni tad-DNA speċifiċi għall-ispeċi (ITS, b-tubulin, TEF 1α) ikkoinċidew kompletament mas-sekwenzi tar-razez ta’ I. crassa li studjajna qabel (Chudinova et al., 2019, Tabella 1). Biex tiġi studjata l-prevalenza ta 'I. crassa f'reġjuni oħra u biex tanalizza l-ispettru ta' kulturi affettwati, ġew analizzati sekwenzi analogi ta 'DNA fid-database GenBank (Tabella 1). Il-koinċidenza kienet ta '86 sa 100%. Is-sekwenzi tat-tliet reġjuni kollha tad-DNA tar-razza I. patata "patata" kienu identiċi għas-sekwenzi tar-razez iżolati mill-bozza tal-lily u l-għeruq tan-narċis fl-Olanda u mill-għerq tal-ġinseng fil-Kanada. Aħna naqsu milli nsibu razez oħra ta 'I. crassa bi tliet sekwenzi simili analizzati f'databases miftuħa. Madankollu, analiżi tas-sekwenzi depożitati ta 'ITS u b-tubulin urew il-preżenza ta' I. crassa fuq weraq tat-tulipani fir-Renju Unit. Fungi b’sekwenza ITS simili ġew identifikati fl-analiżi tal-mikobjota ta ’għeruq ta’ aspen fil-Kanada u għeruq tal-fagu fl-Italja, tuberi tal-patata fl-Arabja Sawdita (Tabella 1). Ir-riżultati ta 'dan l-istudju juru li I. crassa għandu distribuzzjoni globali u kapaċi jinfetta diversi speċi ta' pjanti.
Meta ġiet iddeterminata l-patoġeniċità fuq flieli ta 'tadam u patata fil-5 jum, id-dijametru tal-leżjoni laħaq 1.5 ċm. Ir-razza investigata ma infettatx il-frott tat-tadam sħiħ u t-tuberu tal-patata intatt. Madankollu, is-sepali ġew affettwati fuq it-tadam. Biex tiġi eskluża l-possibbiltà ta 'kontaminazzjoni, iżolat fungali mill-miċelju żviluppat fuq porzjon ta' tuberu tal-patata ġie iżolat f'kultura pura. Kien kompletament identiku għar-razza tal-ġenituri. Apparentement, I. crassa huwa parassita tal-ferita.
It-trattament tat-tħawwil minn qabel tat-tuberi taż-żerriegħa bil-funġiċidi jnaqqas l-iżvilupp ta 'mard fuq il-pjanti matul l-istaġun tat-tkabbir. Għall-għażla ta 'funġiċidi effettivi, huwa importanti li jiġi vvalutat liema minnhom huma effettivi kontra I. сrassa. Ix-xogħol studja s-sustanzi attivi mifruxa tal-funġiċidi - fludioxonil, azoxystrobin, difenoconazole. Fludioxonil huwa nkluż f'diversi taħlitiet użati għall-ilbies ta 'żrieragħ u tuberi taż-żerriegħa qabel ma jitħawlu. Fludioxonil (Maxim) jintuża wkoll biex jikkura tuberi taż-żerriegħa qabel il-ħażna. Difenoconazole u azoxystrobin huma nklużi wkoll f'numru ta 'preparazzjonijiet użati għall-ipproċessar ta' materjal taż-żerriegħa, kif ukoll fi preparazzjonijiet maħsuba għall-ipproċessar ta 'pjanti veġetattivi (Katalgu Statali ..., 2020).
Ir-rata ta 'tkabbir ta' I. crassa ġiet studjata fuq medja (Fig. 2) b'konċentrazzjonijiet differenti ta 'ingredjenti attivi: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobin (EC50 = 4 ppm), u difenoconazole (EC50 = 7.4 ppm) (Tabella 2). Dawn il-preparazzjonijiet jistgħu jitqiesu effettivi ħafna kontra I. crassa, billi l-EC50 tagħhom hija sinifikament inqas mill-konċentrazzjoni rakkomandata tal-preparazzjoni fil-fluwidu tax-xogħol użat għat-trattament tat-tuberi. Skond il-Katalgu ta 'l-Istat ... (2020), il-konċentrazzjoni ta' fludioxonil fil-likwidu għat-trattament tat-tuberi tal-patata hija minn 500 sa 1000 ppm, azoxystrobin (fil-likwidu għat-trattament tal-qiegħ tal-kanal) - 3750-9375 ppm, difenoconazole (fil-likwidu għat-trattament ta 'pjanti veġetattivi) - 187.5– 625 ppm.
Tabella 1. Xebh ta 'sekwenzi ta' sekwenzi speċifiċi għall-ispeċi tar-razza 18KSuPT2 u r-razez ta 'Ilyonectria crassa disponibbli fid-database Genbank
Strain | Pjanta ospitanti, sit tat-tneħħija | Numri ta 'sekwenza depożitati f'GenBank, persentaġġ ta' similaritajiet | Link | ||
ITS | β-tubulin | TEF 1α | |||
17KSPT1 u 18KSuPT2 | Tuberu tal-patata, reġjun ta 'Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, dan ix-xogħol |
CBS 158/31 | Għeruq tan-Narcissus, l-Olanda | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Basla tal-ġilju, l-Olanda | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Għerq tal-ġinseng, il-Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Tulip leaf, ir-Renju Unit | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Għeruq Aspen, il-Kanada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Fagu, l-Italja | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Sottomissjoni diretta |
KAUF19 | Tuberu tal-patata, l-Arabja Sawdita | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = mhux iddepożitat
Tabella 2. Reżistenza ta 'Ilyonectria crassa għal funġiċidi
(sustanza attiva) | EC50, ppm | ||||
Jum 3 | Jum 5 | Jum 7 | |||
Kontroll | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, KE (difenokonażol) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
Fix-xogħol tagħna, razez ta 'I. crassa ġew iżolati minn tuberi tal-patata fir-reġjuni ta' Kostroma u Moska (Chudinova et al., 2019). Proporzjon għoli ta ’razez fungali b’sekwenzi ITS identiċi għal I. crassa ġie żvelat meta ġiet analizzata l-mikobjota tat-tuberi tal-patata fl-Arabja Sawdita (Gashgari u Gherbawy, 2013). Apparentement, I. crassa mhix rari fuq il-patata kif jista 'jidher. L-esperimenti tagħna wrew li l-fungus jista 'jinfetta frott tat-tadam bil-ħsara. Huwa magħruf mil-letteratura li I. crassa huwa kapaċi jiżviluppa fil-ħamrija b’mod saprotrofiku (Moll et al., 2016), kif ukoll jaffettwa varjetà ta ’pjanti, anke dawk bogħod tassonomikament bħal daffodils, ġilji, ġinseng, aspen, u fagu (Tabella 1). waħda). Apparentement, ħafna pjanti selvaġġi u tal-ġnien jistgħu jkunu riservi ta 'I. crassa. Dan t'hawn fuq juri li meta jiġu żviluppati miżuri ta 'protezzjoni, huwa meħtieġ li titqies il-possibbiltà li jiġu affettwati tuberi tal-patata b'dan il-fungus. Preparazzjonijiet mifruxa għat-trattament ta 'tuberi tal-patata li fihom fludioxonil, azoxystrobin u difenoconazole wrew effikaċja funġiċida għolja kontra I. crassa.
Dan ix-xogħol kien appoġġat mill-Fondazzjoni Russa għar-Riċerka Bażika (Għotja Nru 20-016-00139).
L-artiklu ġie ppubblikat fil-ġurnal "Bulettin għall-Ħarsien tal-Pjanti", 2020, 103 (3)